Μέθοδοι
Οι αναλυτικές δοκιμασίες της αιμόστασης χωρίζονται αδρά σε χρονομετρικές (λειτουργικές), χρωμογόνες (που μπορεί να είναι επίσης λειτουργικές ή ανοσολογικές) και ανοσολογικές.
Οι λειτουργικές μέθοδοι βασίζονται στην επαφή θρομβογόνου ουσίας με το πλάσμα του εξεταζόμενου, καταγραφή του χρόνου που ξεκινά με την προσθήκη CaCl2 και σταματά όταν σχηματισθούν τα πρώτα ίχνη ινικής, τα οποία συνήθως ανιχνεύονται θολωσιμετρικά στους αυτόματους αναλυτές. Το αποτέλεσμα συγκρίνεται πάντα με αυτό τυποποιημένου δείγματος γνωστής δραστικότητας.
Οι χρωμογόνες μέθοδοι βασίζονται στην εφαρμογή χρωμογόνων υποστρωμάτων, δηλαδή συνθετικών ολιγοπεπτιδίων που μοιάζουν με το φυσιολογικό υπόστρωμα του ενζύμου, του οποίου μετριέται η δραστικότητα. Αποτελούνται, συνήθως, από 3-5 συνθετικά αμινοξέα και προστατεύονται στο Ν-τελικό άκρο από ειδική ομάδα (PG protecting group). Στο C-τελικό άκρο του πεπτιδίου είναι συνδεδεμένη η χρωμογόνους ουσία (πάρα-νιτροανιλίνη) ή ένα φθοριόχρωμα. Το σημείο αυτό κόπτεται από το ειδικό για κάθε παράγοντα ή ανασταλτή της πήξης ένζυμο, με αποτέλεσμα την παραγωγή χρώματος ή φθορισμού αντίστοιχα. Π.χ. για τον προσδιορισμό της αντιθρομβίνης προστίθεται στο πλάσμα γνωστή ποσότητα θρομβίνης–αντιδρούν οι δυο ουσίες και απομένει ποσότητα θρομβίνης η οποία επιδρά στο χρωμογόνουπόστρωμα. Συνεπώς η παραγωγή χρώματος είναι ανάλογη με την εναπομείνασα ποσότητα θρομβίνης και αντιστοιχεί στην αντιθρομβίνη του ασθενή. Το χρώμα μετράταιφασματοφωτομετρικά και ανάγεται σε επί τοις % δραστικότητα του ενζύμου.
Οι ανοσολογικές μέθοδοι στηρίζονται στην αντίδραση αντιγόνου (είναι η προς μέτρηση ουσία)- αντισώματος και περιλαμβάνουν τις ποσοτικές ανοσοενζυμικές μεθόδους (ELISA), καθώς επίσης και τις ποιοτικές που είναι η ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρηση, ανοσοθολοσιμετρικές μεθόδους οι οποίες υπό ορισμένες συνθήκες μπορούν να εκφραστούν και ποσοτικά.
Προετοιμασία ασθενούς
Η φλεβοκέντηση και η αιμοληψία γίνεται από έμπειρο και εκ- παιδευμένο προσωπικό. Ο ασθενής πρέπει να είναι ήρεμος και ξεκούραστος, χωρίς άγχος (γιατί αυτό ενεργοποιεί την πήξη αυξάνοντας τους παράγοντες VIII, vWF, ταυτόχρονα αυξάνει και την ινωδολυτική δραστηριότητα. Επίσης, θα πρέπει να έχουν περάσει 12 ώρες περίπου από το τελευταίο γεύμα, ώστε να μην επηρεάζεται η δοκιμασία από την παρουσία λιπιδίων στο αίμα.
Τρόπος αιμοληψίας
Η αιμοληψία γίνεται με βελόνα ευρύστομη. Η συλλογή γίνεται με ελεύθερη ροή εντός του βαθμονομημένου ειδικού σωληναρίου και χωρίς να ενεργοποιείται η πήξη από τον πολλαπλό τραυματισμό του τοιχώματος του αγγείου, για την αναζήτηση της φλέβας. Εφόσον είναι εφικτό, αποφεύγεται η περίδεση, ή χρησιμοποιείται μόνο για να φανεί η φλέβα και πάντως όχι σφιχτά και όχι για πάνω από 1 λεπτό. Αν η εφαρμογή της περίδεσης διαρκέσει πάνω από 1 λεπτό, τότε αυξάνονται τα επίπεδα των παραγόντων VIII, vWF και του ινωδολυτικού συστήματος. Απορρίπτεται αιμοληψία με σύριγγα και αναρρόφηση!
Συλλογή αίματος
Το αίμα συλλέγεται με αναλογία όγκων 9:1 (αίματος\ αντιπηκτικού) σε πλαστικά ή σιλικονισμένα σωληνάρια που περιέχουν κι-τρικό νάτριο ως αντιπηκτικό, 0,109Μ, διαλυμένο σε ρυθμιστικόδιάλυμα της πήξης (buffer Owren – Koller, ph 7,4). Κατόπιν φυγοκεντρείται στις 2500g για 20min και διαχωρίζεται το υπερκείμενο πλάσμα με προσοχή. Η συλλογή αίματος επεξεργασία των δειγμάτων γίνεται αμέσως, ή τοποθετούνται σε aliquots τουλάχιστον στους -20ο C (προτιμάται η κατάψυξη στους -80Οc όπου και διατηρούνται για μεγάλο διάστημα). H απόψυξη των δειγμάτων γίνεται στους 37οC (για την αποφυγή σχηματισμού κρυοκαθιζημάτων).
Περιορισμοί μεθόδων
Απορρίπτεται η εξέταση αιμολυμένων ή λιπαιμικών δειγμάτων. Απορρίπτεται επίσης η παρουσία μικροθρόμβων μαρτυρεί ενεργοποίηση της πήξης γιατί επιφέρει βράχυνση των χρόνων πήξης (αυτοκαταλυτική ενεργοποίηση όλων των παραγόντων), ενώ η εκτεταμένη πήξη επιφέρει επιμήκυνση των χρόνων πήξης εξαιτίας της κατανάλωσης παραγόντων και ινωδογόνου.
